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                Cleanert PPT應用于人血清中溶血磷脂酰膽堿的檢測
                發布日期:2019-03-28

                背景

                溶血磷脂酰膽堿(lyso-Phosphatidylcholines,LPCs)是磷脂的一種,具有多種生理功能,與糖尿病、動脈粥樣硬化、血脂異常等代謝性疾病和心血管疾病密切相關。LPCs主要在肝臟代謝,在肝臟疾病和肝毒性中可發生明顯變化;近年來,學者們對多種肝臟疾病和化學性肝毒性模型的大量研究均涉及了LPCs。

                本應用案例介紹一種液相色譜-串聯質譜的方法,采用Cleanert PPT 96孔板凈化人血清樣品,從血清樣品中富集LPC 14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0、LPC 18:0五種溶血磷脂酰膽堿,該方法具有良好的穩定性及可靠性,可為溶血磷脂酰膽堿臨床研究提供一種解決方案。

                材料及儀器

                Cleanert PPT 蛋白沉淀板,Cleanert M96 生物樣品前處理儀,Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀,96孔收集板,Durashell C18(L)(3.0*50 mm, 5 μm,150?),以上產品均為天津博納艾杰爾科技有限公司產品;LC-MS/MS, API 4000+(SCIEX);LPC 14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0、LPC 18:0(以上5種標準品購自Avanti);利血平(內標);甲醇;甲酸;水;生理鹽水(0.9%);甲酸銨。

                樣品處理方法

                樣品混合

                由于難以獲得不含目標物的基質,本實驗使用生理鹽水代替人血清進行方法學驗證試驗。為保護人血中溶血磷脂酰膽堿,試驗中使用的甲醇均含有0.1% 2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)。

                標準曲線及重現性試驗中,基質為生理鹽水,試驗中取20μL生理鹽水,加入5μL 標準工作液,渦旋混合均勻,待下一步凈化。

                人血清加標試驗中,取20μL血清,加入5μL 標準工作液,渦旋混合均勻,待下一步凈化。

                蛋白沉淀過程

                先向Cleanert PPT每孔中加入150μL甲醇(含100ppb利血平),再加入預混合的樣品,渦旋混合均勻,靜置10min,使用Cleanert M96將溶液收集至潔凈收集板內。

                Cleanert V96溫度設定為30℃,將收集板里的溶液氮吹干,使用1mL 80%甲醇水復溶,渦旋混合均勻,進樣測試。

                儀器檢測條件

                HPLC條件

                色譜柱:Durashell C18(L) (3.0*50mm 5um 150?)

                流速:800uL/min

                柱溫:30℃

                進樣量:5 μL

                流動相條件

                Total Time(min)

                0.1%甲酸25mM甲酸銨-水   (%)

                0.1%甲酸-甲醇(%)

                0

                70

                30

                0.5

                50

                50

                1

                0

                100

                4

                0

                100

                4.1

                70

                30

                5

                STOP

                質譜條件

                掃描模式:電噴霧電離正模式

                采集模式:多反應監測(MRM)

                表2 參數信息

                目標物

                tR/min

                Q1

                Q3

                DP

                CE

                利血平

                2

                609.3

                448.2

                140

                40

                609.3

                195*

                120

                45

                C14:0

                2.46

                468.4

                285.3

                110

                40

                468.4

                450.4*

                120

                27

                C15:0

                2.54

                482.3

                299.5

                120

                36

                482.3

                464.2*

                120

                28

                C16:0

                2.63

                496.4

                478.2*

                124

                16

                C17:0

                2.72

                510.4

                327.2

                120

                30

                510.4

                492.4*

                120

                20

                C18:0

                2.83

                524.5

                341.5

                115

                28

                524.5

                506.2*

                127

                18

                注:*為定量離子對

                結果

                線性范圍與靈敏度為考察方法線性范圍,配置系列標準工作液,取5μL標準工作液至20μL生理鹽水中進行前處理操作,獲得的樣品濃度參見 3中S1~S7,曲線方程等信息參見表3.

                表3 標準曲線濃度及線性關系

                項目

                C14:0

                C15:0

                C16:0

                C17:0

                C18:0

                S1/ppm

                0.125

                0.25

                3.75

                0.375

                2.5

                S2/ppm

                0.25

                0.5

                7.5

                0.75

                5

                S3/ppm

                0.5

                1

                15

                1.5

                10

                S4/ppm

                1.25

                2.5

                37.5

                3.75

                25

                S5/ppm

                2.5

                5

                75

                7.5

                50

                S6/ppm

                3.75

                7.5

                112.5

                11.25

                75

                S7/ppm

                7.5

                15

                225

                22.5

                150

                曲線方程

                y=0.725x+0.00264

                y=0.212x-0.0256

                y=0.212x+0.268

                y=0.366x+0.00653

                y=0.31x+0.287

                相關系數

                0.9965

                0.9913

                0.9956

                0.9938

                0.9961

                LOQ/ppm

                0.027

                0.12

                0.32

                0.059

                0.072

                方法精密度與準確度

                實驗中取生理鹽水為基質,進行兩個濃度(S3,S5)的加標回收率實驗,分別進行兩個平行樣,結果見表4.

                為考察方法精密度與準確度,取濃度水平為S3與S5分別進行8個樣品的平行試驗,S3對應LQC,S5對應HQC,基質為生理鹽水,實驗獲得的數據見表5。

                表4 生理鹽水基質加標回收率數據

                項目

                C14:0

                C15:0

                C16:0

                C17:0

                C18:0

                低加標濃度/ppm

                1.25

                2.5

                37.5

                3.75

                25

                高加標濃度/ppm

                3.75

                7.5

                113

                11.3

                75

                低-實測濃度-1/ppm

                1.29

                2.28

                38.1

                3.31

                24.3

                低-實測濃度-2/ppm

                1.44

                2.85

                43

                4.09

                28.1

                低-回收率-1

                103.2%

                91.2%

                101.6%

                88.3%

                97.2%

                低-回收率-2

                114.4%

                114.0%

                114.7%

                109.1%

                112.4%

                高-實測濃度-1/ppm

                3.44

                6.77

                102

                9.83

                69.9

                高-實測濃度-2/ppm

                3.35

                6.53

                103

                9.94

                69

                高-回收率-1

                91.7%

                90.3%

                90.3%

                87.0%

                93.2%

                高-回收率-2

                89.3%

                87.1%

                91.2%

                88.0%

                92.0%

                表5 生理鹽水基質精密度與準確度數據

                項目

                C14:0

                C15:0

                C16:0

                C17:0

                C18:0

                LQC平均回收率(n=8)

                96.3%

                99.9%

                103.6%

                96.6%

                100.0%

                CV(n=8)

                6.3%

                6.4%

                8.5%

                7.1%

                7.0%

                HQC平均回收率(n=8)

                96.8%

                99.1%

                97.5%

                93.8%

                97.7%

                CV(n=8)

                11.3%

                12.1%

                12.3%

                12.0%

                11.3%

                由表4及表5可見,此方法可用于處理及檢測生理鹽水基質中的溶血磷脂酰膽堿,為進一步考察方法對于血清樣本的適應性,特取人血清進行加標回收率考察,獲得數據見表6.由于人血清中含有濃度可觀的溶血磷脂酰膽堿,實驗檢測兩份人血清樣品用于扣除內源性溶血磷脂酰膽堿,加標回收率計算公式為:

                  Cleanert PPT應用于人血清中溶血磷脂酰膽堿的檢測

                CA—加標樣實測濃度

                CM—人血清樣品平均濃度

                CS—加標濃度

                表6 人血清基質實驗數據

                項目

                C14:0

                C15:0

                C16:0

                C17:0

                C18:0

                低加標濃度/ppm

                1.25

                2.5

                37.5

                3.75

                25

                高加標濃度/ppm

                3.75

                7.5

                113

                11.3

                75

                人血清樣品-1/ppm

                0.827

                2.46

                107

                2.92

                47.3

                人血清樣品-2/ppm

                0.678

                2.21

                92

                2.45

                39.4

                低-實測濃度-1/ppm

                1.97

                4.5

                140

                6.24

                72

                低-實測濃度-2/ppm

                2.17

                4.99

                136

                6.67

                70

                低-回收率-1

                97.4%

                86.6%

                108.0%

                94.8%

                114.6%

                低-回收率-2

                113.4%

                106.2%

                97.3%

                106.3%

                106.6%

                高-實測濃度-1/ppm

                4.8

                9.46

                196

                13.8

                113

                高-實測濃度-2/ppm

                4.72

                9.69

                216

                14.8

                122

                高-回收率-1

                107.9%

                95.0%

                85.4%

                98.4%

                92.9%

                高-回收率-2

                105.3%

                98.1%

                103.1%

                107.2%

                104.9%


                Cleanert PPT應用于人血清中溶血磷脂酰膽堿的檢測

                圖1 標準曲線S2點色譜圖

                圖2 人血樣品色譜圖

                實驗結論

                本應用使用蛋白沉淀的方式對生理鹽水及人血清進行前處理,并使用LC-MS/MS檢測溶血磷脂酰膽堿,結果表明本方法簡單、穩定、易操作,可快速處理檢測人血清中溶血磷脂酰膽堿含量,用于臨床研究。

                實驗所用產品列表

                產品名稱

                規格/包裝

                訂貨號

                Cleanert PPT

                96孔板,1mL/well

                96CD1025-M

                Cleanert M96 生物樣品前處理儀

                與96孔板匹配

                SPE-M96

                Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀

                與96孔板匹配

                NV-96G

                96孔收集板

                2mL/well,與96孔板匹配

                96SP2036-Y

                Durashell C18(L)

                3.0*50mm,5μm,150?

                DC950503-L

                甲醇

                LC-MS級,   4*2.5L

                LC230

                LC-MS級,4*2.5L/箱

                LC365

                在線客服

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