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                基于Cleanert SLE高通量萃取血漿中維生素A與維生素E
                發布日期:2019-03-29

                維生素A對人體多種器官的發育以及人體正常生理機能的維護有不可或缺的作用,然而過量攝入維生素A會引發毒副作用;維生素E作為一種抗氧化劑在體內的主要功能是保護細胞的生物膜結構,最近發現維生素E也能調控基因表達,維生素E缺乏癥雖少見,卻與新生兒發育不良和遺傳代謝病相關。因此,準確測定人體內維生素A與維生素E具有重要意義。維生素A與維生素E由于化學性質活潑,易被氧化,對這類物質的準確定量具有很大的挑戰。

                本應用案例介紹一種液相色譜-串聯質譜的方法,采用Cleanert SLE 96孔板凈化血漿樣品,從血漿樣品中萃取富集維生素A(視黃醇,VA)、α-生育酚(α-VE)和γ-生育酚(γ-VE),實驗方法具有良好的穩定性及可靠性,可為VA、VE臨床研究提供一種解決方案。

                目標物信息

                基于Cleanert SLE高通量萃取血漿中維生素A與維生素E

                材料及儀器

                Cleanert SLE 96孔板(200μL/well),Cleanert M96 生物樣品前處理儀,Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀,96孔收集板,Bonshell C18(2.1*100 mm, 2.7 μm),以上產品均為天津博納艾杰爾科技有限公司產品;LC-MS/MS, API 4000+(SCIEX);VA、α-VE、γ-VE、d6-α-VE、d4-γ-VE(以上5種標準品購自altascientific);d6-VA(購自BUCHEM BV);甲醇;甲酸;水;異辛烷;異丙醇;2, 6-二叔丁基對甲酚。

                樣品處理方法

                樣品預處理

                由于VA與VE穩定性差,為防止被氧化,在實驗中需要加入抗氧化劑,所用抗氧化劑為2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)。

                取100 μL血漿至潔凈樣品瓶中,加入內標溶液,再加入50 μL異丙醇和50 μL水溶液,渦旋振蕩混勻。

                SLE過程

                上樣:將預混合好的溶液全部上樣,靜置5 min;

                洗脫:2 mL 異辛烷/異丙醇 (9/1,含1 g/L BHT)洗脫,每次加入500 μL,分四次洗脫,合并洗脫液;最后一步洗脫結束,將Cleanert SLE與收集板整體放到Cleanert M96 生物樣品前處理儀上,開啟壓力至0.005 MPa,約30 s,完全收集洗脫液。

                將洗脫液在室溫下用Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀進行溫和氮吹干,再使用500μL 0.1%甲酸甲醇(含1 g/L BHT)復溶,進樣檢測。

                儀器檢測條件

                HPLC條件

                色譜柱:Bonshell C18(2.1*100 mm, 2.7 μm)

                流速:200 μL/min

                柱溫:30 ℃

                進樣量:5 μL

                流動相條件:100%有機相(0.1%甲酸甲醇)等度分離6min

                質譜條件

                掃描模式:電噴霧電離正模式

                采集模式:多反應監測(MRM)

                表1 參數信息

                化合物

                保留時間/min

                Q1

                Q3

                CE

                VA

                1.87

                269.3

                93.1

                31

                269.3

                81.2

                23

                d6-VA

                1.85

                274.3

                88

                33

                274.3

                212.3

                27

                α-VE

                4.3

                431.5

                165.1

                25

                431.5

                137

                57

                d6-α-VE

                4.25

                437.4

                171.1

                26

                437.4

                110.9

                26

                γ-VE

                3.79

                417.5

                151.2

                25

                417.5

                304.3

                14

                d4-γ-VE

                3.76

                421.6

                155.1

                26

                421.6

                111.1

                22

                結果

                線性范圍與靈敏度

                根據目標物在人體內的含量范圍確定標準曲線濃度范圍,試驗中使用不含目標物的血漿樣品配制7個不同濃度的校準曲線點,VA的濃度分別為:0.05、0.15、0.3、0.5、0.8、1、5 μg/mL;α-VE的濃度分別為:1、2、4、8、10、20、25 μg/mL;γ-VE的濃度分別為:0.2、0.5、1、1.5、3、4.5、8 μg/mL;所得樣品采用上述樣品前處理方法凈化樣品并進行檢測,獲得結果見表2。

                表2 線性范圍及靈敏度

                化合物

                回歸方程

                相關系數(r2)

                方法定量限LOQ(μg/mL)

                VA

                y = 1.3073x + 0.5242

                0.9963

                0.012

                α-VE

                y = 1.5237x + 0.1241

                0.9914

                0.022

                γ-VE

                y = 2.744x + 0.0425

                0.9979

                0.034

                方法精密度與準確度

                為考察方法精密度與準確度,取低、中、高三個濃度的樣本,每個濃度平行處理6個樣,獲得數據見表3.

                表3 精密度與準確度

                化合物

                加標濃度μg/mL

                平均回收率(n=6)

                RSD(n=6)

                VA

                0.15

                99.6%

                6.9%

                0.5

                94.7%

                7.4%

                1

                95.4%

                1.7%

                α-VE

                2

                92.1%

                9.6%

                8

                107.1%

                6.6%

                20

                93.0%

                4.9%

                γ-VE

                0.5

                101.3%

                3.5%

                1.5

                112.2%

                6.8%

                4.5

                104.5%

                3.7%

                色譜圖

                將經Cleanert SLE凈化的樣品按上述LC-MS/MS測試條件進行測試,獲得譜圖見圖4-6.

                血樣中大量存在的磷脂是造成液質聯用基質效應的主要原因,為考察Cleanert SLE技術去除磷脂的能力,特取磷脂兩對特征離子對同時進行考察:496/184,524/184,獲得譜圖見圖7.

                基于Cleanert SLE高通量萃取血漿中維生素A與維生素E

                圖4 VA血漿加標色譜圖(濃度為0.15μg/mL)

                圖5 α-VE血漿加標色譜圖(濃度為2μg/mL)

                圖6 γ-VE血漿加標色譜圖(濃度為0.5μg/mL)

                圖7 血漿加標樣磷脂色譜圖

                結論   

                本應用介紹了一種簡單、高效的樣品前處理方法,通過Cleanert SLE 96孔板可高通量凈化血樣并萃取富集脂溶性維生素A與維生素E,本實驗方法易操作且穩定,可在臨床研究及藥物代謝領域替代耗時、低效的液液萃取技術。

                訂貨信息表

                產品名稱

                規格/包裝

                訂貨號

                Cleanert   SLE 96孔板

                96孔板,200μL/well

                HC2002-9W

                Cleanert M96 生物樣品前處理儀

                與96孔板匹配

                SPE-M96

                Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀

                與96孔板匹配

                NV96-G-S

                96孔收集板

                2mL/well,與96孔板匹配

                96SP2036-Y

                Bonshell C18

                2.1*100mm,2.7μm

                SC921002-0

                甲醇

                LC-MS級, 4*2.5L

                LC230

                LC-MS級,4*2.5L/箱

                LC365

                應用編號:YB10016

                在線客服

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