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                使用Cleanert SLE快速凈化血清中25-羥基維生素D
                發布日期:2019-03-29

                25-羥基維生素D,簡稱25-OH VD,包括25-羥基維生素D2(25-OH VD2)和25-羥基維生素D3(25-OH VD3)作為維生素D在體內的主要代謝形式之一,由于其半衰期長、存在形式穩定而被認為是維生素D營養水平的標志物。如何快速準確檢測人體內維生素D的水平越來越受到廣大學者和醫患人員的重視。液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)具有特異性強、準確性高的特點,被認為是評價維生素D營養狀況的"黃金標準"測定法。本應用案例采用Cleanert SLE 96孔板進行血清樣品前處理,并使用LC-MS/MS進行樣品測試,結果表明該實驗方法具有良好的穩定性及可靠性,可為臨床研究提供一種解決方案。

                目標物信息

                使用Cleanert SLE快速凈化血清中25-羥基維生素D

                材料及儀器

                Cleanert SLE 96孔板(300mg/well)、Cleanert M96 生物樣品前處理儀、Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀、96孔接收板及Durashell C18-L(3.0*50 mm, 5 μm, 150 ?)均來自天津博納艾杰爾科技有限公司;LC-MS/MS, QTRAP 5500(SCIEX);25-OH VD2,25-OH VD3,d3-25-OH VD2以上三種標準品由合作單位提供贊助;d6-25-OH VD3(購自Altascientific);甲醇;甲酸;水;氫氧化鈉;異辛烷。

                樣品處理方法

                樣品預處理

                取100 μL血清至潔凈樣品瓶中,加入內標溶液,再加入100 μL 50 mM氫氧化鈉水溶液混勻后待凈化。

                SLE過程

                上樣:把預處理的樣品全部上樣,待全部浸潤后靜置5 min。

                洗脫:用2 mL的異辛烷進行洗脫,每次洗脫加入500 μL,最后一步洗脫結束,將Cleanert SLE與收集板整體放到Cleanert M96 生物樣品前處理儀上,開啟壓力至0.02 MPa,約30 s,完全收集洗脫液。

                將洗脫液室溫下用Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀進行溫和氮吹干,使用200 μL 0.1% FA 甲醇/水(8/2)復溶,進樣檢測。

                儀器檢測條件

                HPLC條件

                色譜柱:Durashell C18-L(3.0*50 mm, 5 μm, 150 ?)

                流速:500 μL/min

                柱溫:30 ℃

                進樣量:5 μL

                表1 液相條件

                Step

                Total Time(min)

                Flow Rate(μL/min)

                0.1%甲酸 水 (%)

                0.1%甲酸甲醇 (%)

                0

                0

                500

                10

                90

                1

                3.5

                500

                10

                90

                質譜條件

                掃描模式:電噴霧電離正模式

                采集模式:多反應監測(MRM)

                表2 參數信息

                化合物

                保留時間/min

                Q1

                Q3

                CE

                25-OH VD2

                1.81

                413.3

                395.3

                13.5

                413.3

                355.4

                14.1

                d3-25-OH VD2

                1.79

                416.5

                398.4

                12.3

                416.5

                358.5

                15

                25-OH VD3

                1.71

                401.5

                383.5

                13.8

                401.5

                365.5

                15.1

                d6-25-OH VD3

                1.69

                407.5

                389.5

                13.8

                407.5

                371.5

                15.1

                結果

                線性范圍與靈敏度

                使用不含目標物的血清樣品配制10個不同濃度的校準曲線點,25-OH VD2的濃度分別為:2、4、10、30、60、120、200、400、800、1000 ng/mL;25-OH VD3的濃度分別為:1、2、5、15、30、60、100、200、400、500 ng/mL;所得樣品采用上述樣品前處理方法凈化樣品并進行檢測,獲得結果見表3。

                表3 線性范圍及靈敏度

                化合物

                回歸方程

                相關系數(r2

                方法定量限LOQ(ng/mL)

                25-OH VD2

                y=0.00691x+0.043

                0.9998

                1.1

                25-OH VD3

                y=0.0203x+0.398

                0.9995

                0.16

                方法精密度與準確度

                為考察方法精密度與準確度,取低、中、高三個濃度的樣本,每個濃度平行處理5個樣,獲得數據見表4.

                表4 精密度與準確度

                化合物

                加標濃度
                ng/mL

                平均回收率
                n=5

                RSD
                n=5

                25-OH VD2

                4

                101.8%

                8.3%

                30

                95.6%

                7.2%

                200

                96.8%

                4.0%

                25-OH VD3

                2

                100.4%

                12.9%

                15

                95.0%

                6.1%

                100

                93.5%

                4.3%

                色譜圖

                將經Cleanert SLE凈化的樣品按上述LC-MS/MS測試條件進行測試,獲得譜圖見圖3-4.

                血樣中大量存在的磷脂是造成液質聯用基質效應的主要原因,為考察PPT、LLE與Cleanert SLE技術去除磷脂的能力,特取磷脂兩對特征離子對進行考察:496/184, 524/184,獲得對比圖見圖5-6.

                使用Cleanert SLE快速凈化血清中25-羥基維生素D

                圖3 25-OH VD3血清加標色譜圖(濃度為15 ng/mL)

                圖4 25-OH VD2血清加標色譜圖(濃度為30 ng/mL)

                圖5 PPT-LLE-SLE樣品磷脂對比譜圖(離子對496/184)

                圖6 PPT-LLE-SLE樣品磷脂對比譜圖(離子對524/184)

                結論

                本應用呈現了一種簡單、高效的樣品前處理方法,通過Cleanert SLE 96孔板可高通量凈化血樣并萃取富集脂溶性維生素D代謝物25-OH VD2與25-OH VD3,本實驗方法易操作且穩定,可在臨床研究及藥物代謝領域替代耗時、低效的液液萃取技術。

                訂貨信息表

                產品名稱

                規格/包裝

                訂貨號

                Cleanert SLE 96孔板

                96孔板

                HC2002SQ-9W

                Cleanert M96 生物樣品前處理儀

                96孔板匹配

                SPE-M96

                Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀

                96孔板匹配

                NV-96G

                96孔收集板

                2 mL/well,與96孔板匹配

                96SP2036-2

                Durashell C18-L

                3.0*50mm,5μm,150 ?

                DC950503-L

                甲醇

                LC-MS,   4*2.5L

                LC230

                LC-MS級,4*2.5L/

                LC365

                應用編號:YB10011

                在線客服

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